Різниця між клонуванням генів та ПЛР

Ключова різниця - клонування гена проти ПЛР
 

Синтез багатьох копій ДНК із конкретного фрагмента ДНК називається ампліфікацією ДНК. Існує два основні процеси ампліфікації ДНК, а саме клонування генів та ПЛР. Ключова відмінність між клонуванням генів та ПЛР є, клонування генів продукує безліч копій конкретного гена у природніх умовах конструюючи рекомбінантну ДНК і зростаючи всередині бактерії-господаря, тоді як ПЛР створює мільйони копій конкретного фрагмента ДНК в пробірці зазнаючи повторних циклів денатурації та синтезу.

ЗМІСТ
1. Огляд та ключові відмінності
2. Що таке генетичне клонування
3. Що таке ПЛР
4. Поплечне порівняння - генічне клонування проти PCR
5. Підсумок

Що таке ген клонування?

Клонування генів - це техніка, яка використовується для пошуку та розмноження конкретного гена з вилученої геномної ДНК організму шляхом побудови рекомбінантної ДНК. Геномна ДНК містить тисячі різних генів, закодованих для білків. Коли ДНК витягується, вона включає всі можливі гени, які вона може нести. Техніка клонування генів дозволила виявити специфічний ген із загальної ДНК. Тому клонування генів слугує важливим інструментом молекулярної біології.

Створення геномної бібліотеки організму має важливе значення при клонуванні генів, якщо в ДНК немає поняття про розташування відповідного гена. Геномна бібліотека складається з наступних кроків.

Крок 1: Екстракція загальної ДНК з організму, який містить бажаний ген.

Крок 2: Обмеження травлення витягнутої ДНК для отримання невеликих керованих фрагментів. Цьому кроку сприяють рестрикційні ендонуклеази.

Крок 3: Виділення відповідного вектора і відкриття векторної ДНК з використанням тієї ж редукції ендонуклеаз. Бактеріальні плазміди зазвичай використовують як вектори для перенесення чужорідної ДНК. Плазміди - це невеликі кола ДНК, розташовані всередині бактерій.

Крок 4: Поєднання векторної ДНК та фрагментованої ДНК для отримання рекомбінантної молекули ДНК. Цей крок регулюється ДНК-лігазою.

Крок 5: Перенесення рекомбінантних молекул ДНК у бактерії-господарі. Цей крок відомий як трансформація і проводиться за допомогою теплового удару.

Крок 5: Скринінг трансформованих бактеріальних клітин на культуральному середовищі. Змішана популяція трансформованих і нетрансформованих клітин-господарів отримується в кінці процесу трансформації. Оскільки інтерес до гена входить лише в трансформовані клітини-господарі. Отже, необхідно вибрати трансформовані клітини. Виділення проводиться з використанням селективних середовищ, які містять антибіотики. На цьому скринінг-середовищі ростуть лише трансформовані клітини, що дозволяють здійснювати вибір.

Крок 6: Вирощування бактерій для отримання генотеки. На цьому етапі трансформовані клітини-господарі вводяться у свіжий культуральний носій, що забезпечує оптимальні вимоги росту. Всього колоній на культуральних табличках представляє геномну бібліотеку цього організму.

Крок 7: Молекула рекомбінантної ДНК, що містить цікавий ген, повинна бути перевірена на тисячі клонованих фрагментів рекомбінантної ДНК. Це може бути досягнуто за допомогою зондів, які відзначають конкретний ген або специфічний білок, отриманий з цього гена.

Після того, як зацікавлений ген, що містить колонію бактерій, ідентифікується із загальної кількості колоній, можна зробити мільйони копій рекомбінантної плазміди, що містить ген.

Клонування генів використовується при створенні бібліотек генів, виробляючи спеціальний білок, вітаміни, антибіотики, гормони, секвенування та картографування геномів організмів, роблячи кілька копій ДНК особин у криміналістиці тощо.

Рисунок_1: клонування гена

Що таке ПЛР?

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це техніка, яка генерує велику кількість копій певного фрагмента ДНК. Експоненціальна ампліфікація конкретної послідовності ДНК отримують за допомогою ПЛР за в пробірці умови. Ця методика є дуже потужним інструментом у молекулярній біології, оскільки дозволяє розмножувати невеликий зразок ДНК на кількість, яка може бути використана. ПЛР була введена Карі Муллісом у 1983 році, і цей призовий винахід створив величезний прогрес у молекулярній біології.

Метод ПЛР слід за повторними реакціями ПЛР, як показано на малюнку 02. Одна реакція ПЛР складається з трьох основних етапів, що відбуваються при трьох різних температурах; денатурація дволанцюгової ДНК при 94 ⁰C, відпал праймерів при 68 ⁰C і подовження пасма при 72 ⁰C. Отже, коли проводиться ПЛР, для правильної реплікації слід сильно підтримувати коливання температури. ПЛР проводиться в машині ПЛР всередині трубок ПЛР. Пробірки для ПЛР завантажуються правильними сумішами ПЛР, що містять шаблонну ДНК, Taq полімеразу, праймери, dNTP та буфер. Денатурація дволанцюжкової ДНК зразка на однониткову ДНК проводиться шляхом розриву водневих зв’язків між комплементарними основами при 94 - 98 ⁰C. Потім окремі нитки шаблону ДНК піддають впливу праймерів. Необхідно забезпечити пару грунтовки (вперед і назад), і вони повинні бути термостійкими, щоб переносити високі температури. Праймери - це одноцепочечная коротка послідовність ДНК, яка доповнює кінці цільового фрагмента ДНК. У ПЛР використовують синтетичні праймери. Праймери зв'язуються з комплементарними основами ДНК проби і ініціюють синтез нової ланцюга. Цей етап каталізується ферментом, званим Taq полімеразою; термостабільний фермент ДНК-полімерази, виділений із Thermus auqaticus. Коли наявні праймери та нуклеотиди (будівельні блоки), полімераза Taq конструює нову ланцюг ДНК, що доповнює шаблону ДНК. В кінці програми ПЛР спостерігається ампліфікований фрагмент ДНК за допомогою гель-електрофорезу. Якщо потрібен подальший аналіз, продукт ПЛР очищають з гелю.

ПЛР дуже корисна для діагностики та моніторингу генетичних та набутих захворювань, ідентифікації злочинців (у галузі криміналістики), вивчення структури та функції цільового сегмента ДНК, послідовності та відображення геномів організмів тощо. ПЛР стала рутинна лабораторна техніка в наукових лабораторіях медичної та молекулярної біології серед науковців, оскільки вона має широке застосування.

Рисунок_2: ланцюгова реакція полімерази

Яка різниця між геном клонування та ПЛР?

Гена Клонування проти ПЛР
Клонування генів - це процес створення декількох копій конкретного гена у природніх умовах за допомогою рекомбінантної ДНК та перетворення в бактерію-господаря.	Метод ПЛР дає кілька копій певної послідовності ДНК в пробірці через повторні цикли реакцій ПЛР.
Вимога побудови рекомбінантної ДНК
Рекомбінантна ДНК виробляється з метою локалізації гена.	Рекомбінантна ДНК не виробляється.
Потреба праці
Цей процес є трудомістким.	Інтенсивна праця не потрібна.
Процес in vivo або in vitro
Побудова рекомбінантної ДНК є в пробірці а ампліфікація ДНК є у природніх умовах.	Ампліфікація ДНК відбувається повністю в пробірці.

Підсумок - клонування гена проти ПЛР

Клонування генів та ПЛР - два методи, які використовуються для ампліфікації ДНК. ПЛР - це в пробірці процес, який робить кілька копій ДНК певного фрагмента ДНК без використання рекомбінантної ДНК та організму-господаря. Клонування генів - це насамперед ан у природніх умовах процес, який призводить до отримання декількох копій зацікавленого гена всередині організму-господаря шляхом побудови рекомбінантної ДНК. Це різниця між клонуванням генів та ПЛР.

Довідка:
1. Гріффітс, Ентоні JF. "Клонування конкретного гена". Сучасний генетичний аналіз. Національна медична бібліотека США, 01 січня 1999. Веб. 22 лютого 2017 року
2. "Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)." Національний центр інформації про біотехнології. Національна медична бібліотека США, n.d. Веб. 22 лютого 2017 року

Надано зображення:
1. "Малюнок 17 01 06" від CNX OpenStax - (CC BY 4.0) через Wikimedia Commons
2. "PCR" від Madprime - Власна робота (CC BY-SA 3.0) через Wikimedia Commons