Різниця між безпечнішими послідовностями та піросеквенціями

Ключова різниця - безпечніша послідовність і піросеквенція
 

Послідовність ДНК є дуже важливою для аналізу ДНК, оскільки знання правильного розташування нуклеотидів у певній області ДНК виявляє багато важливої ​​інформації про неї. Існують різні методи секвенування ДНК. Захисне секвенування та піросекціонування - це два різні методи секвенування ДНК, які широко використовуються в молекулярній біології. Ключова відмінність послідовності Сангера від Піросеквенції полягає в тому, що Сангер-секвенування використовує дідеоксинуклеотиди для припинення синтезу ДНК для зчитування нуклеотидної послідовності, а піросеквенціювання виявляє вивільнення пірофосфату шляхом включення нуклеотидів та синтезу комплементарної послідовності для зчитування точного порядку послідовності.

ЗМІСТ
1. Огляд та ключові відмінності
2. Що таке безпечне секвенування
3. Що таке піросекція
4. Поплечне порівняння - більш безпечне послідовне розташування проти піросеквенції
5. Підсумок

Що таке безпечне секвенування?

Секвенжерство Сангера - метод секвенування ДНК першого покоління, розроблений Фредеріком Сангером та його коледжами в 1977 році. Він також відомий як Послідовність припинення ланцюга або Дідокси-послідовність оскільки він заснований на припиненні ланцюга дідеоксинуклеотидами (ddNTP). Цей метод широко застосовувався більше 30 років, поки не було розроблено послідовність нового покоління (NGS). Техніка секгенерації Сангера дозволила виявити правильний порядок нуклеотидів або приєднання певного фрагмента ДНК. Він заснований на селективному включенні ддНТП та припиненні синтезу ДНК протягом в пробірці Реплікація ДНК. Відсутність 3 'OH-груп для продовження утворення фосфодіефірної зв'язку між сусідніми нуклеотидами є унікальною особливістю DDNTP. Отже, як тільки DDNTP приєднаний, подовження ланцюга припиняється і закінчується з цієї точки. Існують чотири ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP та ddTTP - використовуються в послідовності Sanger. Ці нуклеотиди зупиняють процес реплікації ДНК, коли вони включаються у зростаючу ланцюг ДНК і призводять до різної довжини короткої ДНК. Капілярний гелефофорез використовується для організації цих коротких ниток ДНК за їх розмірами на гелі, як показано на малюнку 01.

Фігура 1: Електрофорез капілярного гелю синтезованої короткої ДНК

Для в пробірці реплікація ДНК, слід забезпечити мало вимог. Це фермент ДНК-полімерази, шаблонна ДНК, олігонуклеотидні праймери та дезоксинуклеотиди (dNTP). У послідовності Сангера реплікацію ДНК проводять у чотирьох окремих пробірках разом із чотирма типами ДДНТП окремо. Деоксинуклеотиди повністю не замінюються відповідними DDNTP. Суміш конкретного dNTP (наприклад; dATP + ddATP) включається в трубку і реплікується. Чотири окремі пробіркові продукти подаються на гель у чотири окремих лунки. Потім, читаючи гель, послідовність може бути побудована, як показано на Фіг.2.

Малюнок 02: Захищене послідовність

Сингерне ​​секвенування - важлива методика, яка допомагає у багатьох областях молекулярної біології. Проект геному людини був успішно завершений за допомогою методів на основі послідовності Сангера. Захисне секвенування також корисне при послідовності ДНК-мішені, дослідженнях раку та генетичних захворювань, аналізі експресії генів, ідентифікації людини, виявленні патогенів, секвенуванні мікробів тощо.

Є кілька недоліків послідовності Сангера:

• Довжина ДНК, що секвенується, не може бути більше 1000 пар основ
• За один раз можна секвенувати лише одну нитку.
• Процес трудомісткий і дорогий.

Тому з часом були розроблені нові вдосконалені методи секвенування для подолання цих проблем. Однак послідовність Сангера все ще використовується завдяки високоточним результатам до приблизно 850 фрагментів довжини базової пари.

Що таке піросекція?

Піросеквенціювання - це нова методика секвенування ДНК, заснована на "послідовності шляхом синтезу". Ця методика спирається на виявлення вивільнення пірофосфату при включенні нуклеотидів. У цьому процесі використовуються чотири різних ферменти: ДНК-полімер, сульфурилаза АТФ, люцифераза та апіраза та два субстрати аденозину 5 'фосфосульфату (APS) та люциферину.

Процес починається з зв'язування праймера з одноланцюговим шаблоном ДНК, а ДНК-полімераза починає включення комплементарних до нього нуклеотидів. Коли нуклеотиди з’єднуються разом (полімеризація нуклеїнової кислоти), він вивільняє пірофосфатні (дві фосфатні групи, зв'язані разом) групи та енергію. Кожне додавання нуклеотидів вивільняє еквімолярну кількість пірофосфату. Пірофосфат перетворюється в АТФ сульфурилазой АТФ у присутності субстрату APS. Сформований АТФ рухає опосередковану люциферазою конверсію люциферину в оксилуциферин, виробляючи видиме світло у кількостях, пропорційних кількості АТФ. Світло виявляється за допомогою пристрою детектування фотонів або фотопомножувача і створює пірограму. Апіраза погіршує АТФ і невключені dNTP в реакційній суміші. Додавання dNTP проводиться раз за разом. Оскільки додавання нуклеотиду відоме відповідно до включення та виявлення світла, послідовність шаблону може бути визначена. Пірограма використовується для генерації нуклеотидної послідовності ДНК зразка, як показано на малюнку 03.

Піросеквенція дуже важлива при аналізі одномолекулярного поліморфізму та послідовності коротких ділянок ДНК. Висока точність, гнучкість, простота автоматизації та паралельної обробки є перевагами піросекціонування над методами секвенування Сангера.

Малюнок 03: Піросекція

Яка різниця між безпечним секвенуванням та піросеквенціюванням?

Загрозні секвенування проти піросеквенції
Сангер-секвенування - метод секвенування ДНК, заснований на селективному включенні ddNTPs ДНК-полімеразою та припиненням ланцюга.	Піросеквенціювання - це метод секвенування ДНК, заснований на виявленні вивільнення пірофосфату при включенні нуклеотиду.
Використання ddNTP
ddNTP використовуються для припинення реплікації ДНК	DDNTP не використовуються.
Ензими, що беруть участь
Використовується ДНК-полімераза.	Використовуються чотири ферменти: ДНК-полімераза, АТФ сульфурілаза, Люцифераза та Апіраза.
Використовувані підкладки
APS і Luciferin не використовуються.	Використовують аденозин 5 'фосфосульфат (APS) та люциферин.
Максимальна температура
Це повільний процес.	Це швидкий процес.

Підсумок - Захищена секвенування проти піросеквенції

Сингерне ​​секвенування та піросекціонування - два методи секвенування ДНК, які використовуються в молекулярній біології. Сингерне ​​секвенування будує порядок нуклеотидів послідовно, припиняючи подовження ланцюга, тоді як піросекціонування будує точний порядок нуклеотидів послідовно шляхом включення нуклеотидів та виявлення вивільнення пірофосфатів. Тому основна відмінність секвенування Сангера від піросеквенції полягає в тому, що секгер Сангер працює на секвенуванні ланцюгом за допомогою ланцюга, а піросеквенція працює на послідовності синтезом.

Довідка:
1. Факруддін, Md, і Абхіджіт Чоуддурі. "Піросекціонування - альтернатива традиційній безпечній послідовності". Американський журнал біохімії та біотехнології. Наукові публікації, 02 березня 2012. Веб. 28 лютого 2017 року.
2. "Захищене послідовність". Захисне секвенування - теми ScienceDirect. Н.п., н.д. Веб. 28 лютого 2017 року

Надано зображення:
1. "Дидезоксиметод" Крістоф Ґоманс (модифікація) - доктор Норман Модер, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) через Вікісховище
2. "Sanger-DNA-seq" від Enzo з польської мови Wikipedia (CC BY-SA 3.0) через Вікісховище Commons
3. "Піросеквенція" мікробіологічними байтами (CC BY-SA 2.0) через Flickr