Різниця між ПЛР та секвенуванням ДНК

Ключова різниця - ПЛР та секвенування ДНК
 

ПЛР та секвенування ДНК - дві важливі методики молекулярної біології. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це процес, який створює велику кількість копій фрагмента ДНК. Послідовність ДНК - це техніка, яка призводить до точного порядку нуклеотидів даного фрагмента ДНК. Це ключова відмінність між ПЛР та секвенуванням ДНК. ПЛР є одним з основних кроків, що беруть участь у секвенуванні ДНК.

ЗМІСТ
1. Огляд та ключові відмінності
2. Що таке ПЛР
3. Що таке секвенування ДНК
4. Поплечне порівняння - ПЛР та секвенування ДНК
5. Підсумок

Що таке ПЛР?

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації ДНК, який використовується в молекулярній біології. Він створює тисячі до мільйонів копій певного фрагмента ДНК. Цей метод був розроблений Карі Муллісом в 1983 році. У цій методиці фрагмент ДНК, який потрібно ампліфікувати, служить шаблоном, а фермент ДНК-полімерази додає комплементарні нуклеотиди до праймера, який є в суміші ПЛР. Після закінчення реакції ПЛР синтезується багато копій ДНК зразка.

Існують різні компоненти суміші ПЛР, включаючи ДНК, ДНК-полімеразу (полімераза Taq), праймери (прямі та зворотні праймери), нуклеотиди (будівельні блоки ДНК) та буфер. ПЦР відбувається всередині машини ПЛР, і в машину слід завантажити правильну суміш ПЛР, і правильно запустити програму. Ця методика дозволяє виготовити тисячі до мільйонів копій певного розділу ДНК з дуже невеликої кількості ДНК.

Реакції ПЛР відбуваються циклічно для отримання видимої кількості продуктів ПЛР на гелі. У реакції ПЛР є три основні етапи: денатурація, відпал праймера та розширення нитки, як показано на малюнку 01. Ці три етапи відбуваються при трьох різних температурах. ДНК існують у дволанцюжковій формі водневими зв’язками між комплементарними основами. Перед імплікацією дволанцюжкову ДНК слід відокремити одна від одної. Робиться це шляхом надання високої температури. При високій температурі дволанцюжковий денатурація ДНК на одиничні ланцюги. Потім праймери повинні наблизитися до бокових кінців конкретного фрагмента або гена ДНК. Праймер - це короткий шматок одноланцюгової ДНК, який є доповненням до цільової послідовності. Передній і зворотний праймери відпалюють з комплементарними основами на бокових кінцях денатурованої ДНК проби при температурі відпалу. Грунтовки повинні бути термостійкими. Після того, як праймери віджигають ДНК проби, фермент taq полімерази ініціює синтез нових ланцюгів шляхом додавання нуклеотидів, які є комплементарними до цільової ДНК. Полімераза Taq - це термостійкий фермент, виділений з термофільної бактерії, що називається Thermus aquaticus. Буфер ПЛР підтримує оптимальні умови для дії полімерази taq. Ці три стадії реакцій ПЛР повторюються для отримання необхідної кількості продукту ПЛР. Після кожної реакції ПЛР кількість копій ДНК подвоюється. Отже, в ПЛР можна спостерігати експоненціальну ампліфікацію. Продукти ПЛР можна спостерігати за допомогою гель-електрофорезу і можуть бути очищені для подальших досліджень.

Малюнок 01: Основні етапи реакції ПЛР

ПЛР є цінним інструментом медичних та біологічних досліджень. ПЛР має особливу цінність у криміналістиці, оскільки може ампліфікувати ДНК для досліджень з крихітних зразків злочинців та зробити криміналістичні профілі ДНК. ПЛР широко застосовується в багатьох областях молекулярної біології, включаючи генотипування, клонування генів, виявлення мутацій, секвенування ДНК, мікророзриви ДНК та тестування батьківства тощо.

Малюнок 02: Ланцюгова реакція полімерази

Що таке секвенування ДНК?

Послідовність ДНК - це визначення точного порядку нуклеотидів - аденіну, гуаніну, цитозину та тиміну в заданому фрагменті ДНК. Генетична інформація зберігається в послідовностях ДНК, використовуючи правильний порядок нуклеотидів. Отже, знаходження точного порядку нуклеотидів у фрагменті ДНК дуже важливо знати про будову та функції генів.

Протокол секвенування ДНК включає різні процеси. Перший крок - виділення зацікавленої ДНК або геномної ДНК організму. За допомогою ПЛР (як описано вище) бажану область ДНК слід ампліфікувати. Посилений ПЛР-продукт слід відокремити гель-електрофорезом та очистити. Ампліфіковані фрагменти подаються як шаблони для послідовності. Послідовність послідовностей може бути виконана або за методом послідовності Сангера, або за методом послідовності з високою пропускною здатністю. Для безпечного секвенування потрібен капілярний електрофорез одержуваних фрагментів ДНК. Визначення правильного порядку нуклеотидів може здійснюватися вручну зчитуванням авторадіографів або використанням автоматизованих секвенсаторів ДНК.

Послідовність генів сприяла проекту геному людини і полегшила картинг геному людини в 2003 році. У криміналістиці секвенування ДНК дозволило ідентифікувати осіб, які демонструють унікальні послідовності ДНК та ідентифікують злочинців. У медицині секвенування ДНК можна використовувати для виявлення генів, відповідальних за генетичні та інші захворювання, пошуку генів дефектів та заміни їх правильними генами. У сільському господарстві інформація про послідовність ДНК деяких мікроорганізмів використовується для отримання трансгенних культур з економічно бажаними характеристиками.

Малюнок 03: Послідовність ДНК

У чому різниця між ПЛР та секвенуванням ДНК?

ПЛР проти послідовності ДНК
Процес ПЛР створює тисячі до мільйонів копій зацікавленого фрагмента ДНК.	Послідовність ДНК - це процес визначення точного порядку нуклеотидів у заданому фрагменті ДНК.
Результат
ПЛР створює тисячі до мільйонів копій певного фрагмента ДНК	Це призводить до правильного порядку основ у певному фрагменті ДНК.
Залучення DDNTP
ПЛР не вимагає DDNTP. Він використовує dNTP.	Для секвенування ДНК потрібні ddNTP, щоб припинити формування нитки.

Підсумок - ПЛР та секвенування ДНК

ПЛР та секвенування ДНК є дуже важливим інструментом у багатьох областях молекулярної біології. Ампліфікація фрагментів ДНК проводиться методом ПЛР, тоді як правильний порядок нуклеотидів фрагмента ДНК визначається секвенуванням ДНК. Це різниця між ПЛР та секвенуванням ДНК.

Довідка:
1. "Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)." Національний центр інформації про біотехнології. Національна медична бібліотека США, n.d. Веб. 21 лютого 2017 року.
2. Шендур, Джей та Ханлі Джі. "Послідовність ДНК наступного покоління". Новини природи. Nature Publishing Group, 09 жовтня 2008. Веб. 21 лютого 2017 року

Надано зображення:
1. "Кроки ПЛР" від Tinojasontran - Власна робота (Public Domain) через Commons Wikimedia
2. "Ланцюгова реакція полімерази" від Enzoklop - Власна робота (CC BY-SA 3.0) через Wikimedia Commons
3. "Послідовність ДНК" Автор Сеф - Власна робота (Public Domain) через Вікісховище